Western blotting od kuchni

Białka denaturuj tylko na patelni!

Prąd płynący w czasie elektrotransferu, zgodnie z prawem Ohma, w największym stopniu, jest zamieniany na ciepło. Wywołany tym wzrost temperatury może spowodować termiczną denaturację białek lub ograniczyć ich renaturację,  zwłaszcza epitopów konformacyjnych.  

Zmniejszenie liczby zreanaturowanych epitopów analizowanego białka może negatywnie wpłynąć na poziom  detekcji tych białek za pomocą monoklonalnych lub poliwalentnych przeciwciał.

Wzrost temperatury obserwuje się zwłaszcza w czasie stosowania prądów rzędu kilkuset mA - np w czasie transferu półsuchego.

               

Aby ograniczyć negatywny wpływ wzrostu temperatury na poziom renaturacji białek oraz zachować jak największą powtarzalność i wydajność  transferu  białek można:

  • ograniczyć  natężenie prądu w czasie elektrotransferu - wydłuża to niestety czas trwania transferu
  • odbierać i kontrolować nadmiar ciepła generowanego w czasie transferu
  • stosować poliwalentne przeciwciała pierwszorzędowe (rozpoznają kilka różnych epitopów)

Dla białek bardzo dużych, bardzo małych oraz np. białek zasadowych warto wykonać optymalizację warunków elektrotransferu. Podstawowe etapy takiej optymalizacji obejmują:

  • wybór pomiędzy półsuchym a mokrym transferem
  • optymalizacja warunków prądowych i czasu transferu  np metoda "dwóch membran" 
  • zastosowanie dodatkowych układów do obniżenia i kontroli temperatury w czasie transferu --> nowy model aparatu do Minitrans Mx
  • zapewnie jednorodnego pH w czasie transferu  -> nowy model aparatu do Minitrans Mx
  • wyboru optymalnego układu detekcji kompleksu Ag-przeciwciało na membranie