Bardzo dziękujemy za udział w drugiej części naszego konkursu!

Prawidłowa odpowiedź to "D. n-butanol nasycony wodą"

Tlen obecny w powietrzu jest inhibitorem procesu polimeryzacji chemicznej roztworu bis-akrylamid.  Aby ograniczyć dostęp tlenu do polimeryzującego żelu należy nawarstwić na jego szczyt wodny roztwór np. n-butanolu. Warstwa tego alkoholu nasyconego wodą nie tylko odcina dostęp powietrza do żelu, ale dzięki swej wysokiej polarności ogranicza znacznie dyfuzję roztworu akrylamidów i buforu Tris z żelu dolnego do nawarstwionego roztworu. To, po wylaniu żelu górnego, skutkuje ostrym gradientem wielkości porów pomiędzy żelem zagęszczającym a rozdzielającym oraz zachowuje skokowy gradient siły jonowej i pH pomiędzy tymi żelami. Skokowy gradient pH jest podstawowym czynnikiem odpowiedzialnym za zagęszczenie się prób białkowych na połączeniu obu tych żeli, co jest podstawowym warunkiem uzyskania „ostrych prążków”.

W przypadku nawarstwienia polimeryzującego żelu rozdzielającego „wodą” dochodzi do dyfuzji zarówno niepolimeryzowanych akrylamidów jak i buforu Tris z górnej warstwy żelu rozdzielającego do nawarstwionej wody. Po jej wylaniu, i po spolimeryzowaniu żelu zagęszczającego nie uzyskujemy tak ostrego gradientu stężeń akrylamidów oraz siły jonowej buforu Tris  i pH jak w przypadku gdy użyjemy nasyconego wodą roztworu n-butanolu. Użycie czystego n-butanolu lub innego alkoholu (np. etanolu) spowoduje silne odwodnienie górnej warstwy żelu i utratę jego własności.

GRATULUJEMY!

Polimeryzacja żelu - kilka praktycznych uwag:

1. Wysokość żelu zagęszczającego (odległość pomiędzy dnem studzienki i początkiem żelu rozdzielającego powinna być ok. 2x większa od maksymalnej wysokości prób w studzience

2. Żele nieciągłe polimeryzowane w buforze Tris , powinny być użyte w ciągu maksymalnie 12-24 godzin po spolimeryzowaniu żelu górnego. Dłuższe przechowywanie spolimeryzowanego żelu prowadzi do rozmywania się gradientu pH na granicy obu żeli w wyniku dyfuzji biernej. Przechowywanie w lodówce po spolimeryzowaniu żelu górnego ( najlepiej w pozycji poziomej, owiniętego folia z nawilżonym ręcznikiem papierowym) ogranicza dyfuzję bierną.

3. Po spolimeryzowaniu żelu dolnego, należy w ciągu max. 1 godz. usnąć warstwę nasyconego wodą n-butanlu. W przypadku konieczności dłuższego przechowania spolimeryzowanego żelu dolnego (np. przez noc) zleca się nawarstwić bufor Tris użyty do przygotowani żelu rozdzielającego rozcieńczony 1:4)

4. Roztwór n-butanolu nasycony wodą, przygotujemy mieszając np. dwie równe objętości wody i butanolu (np. po 50 ml) w zakręcanej butelce i intensywnie wytrząsamy przez 1-2 minuty. Roztwór przechowujemy zakręconej butelce w temperaturze pokojowej. bezpośrednio przed użyciem można wstrząsnąć roztwór, i po uformowaniu się dwóch faz pobieramy fazę górną do nawarstwienia na żel dolny.